一代測序原理

Frederick Sanger 是一位1918年出生于美國的生物化學家，曾經兩度獲得諾貝爾化學獎 。上世紀70年代末，他提出快速測定脫氧核糖核酸（DNA）序列的技術“雙脫氧終止法”，也被稱作“Sanger法”。

早在2001年完成的人類基因組框圖，采用的就是該方法。而且因準確率高，直到今天還在廣泛使用，也被稱為基因檢測的金標準。下面我們來看看Sanger法是怎樣測得基因序列的。

Sanger 測序法原理

構建反應系統

Sanger法測序由一套四個單獨的反應構成，每個反應系統包含

• 四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，可以正常合成DNA

• 每個反應系統加入四種不同的雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP)，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，另外為了方便定位，需要用熒光或者同位素標記。

• 目標片段、DNA聚合酶、引物，反應體系

這樣我們的四個反應體系構建完成 (四種顏色分別代表不同的 ddNTP 反應體系)：

擴增目的片段

下一步進行擴增，以目的片段為模板，在DNA聚合酶的催化下，從引物處起始開始復制DNA，當遇到ddNTP，反應停止。

由于反應體系中 dNTP 與 ddNTP 相對濃度的調節，使反應擴增得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。這里是ddNTP與dNTP在復制過程中結合到延長鏈上的幾率，如果ddNTP濃度高，結合幾率高，阻礙鏈延長的幾率就高，那么目的片段復制的長度就短。

也就是說，這些擴增產物具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上。

比如，下圖的復制過程中遇到帶尾巴的黃色核苷酸，一共復制9個堿基。

凝膠電泳

接下來，用凝膠電泳把他們分開，這里使用的是高分辨率變性丙烯酰胺凝膠，并由四個泳道組成，每個泳道對應一種堿基。然后，對凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

序列讀取

最后通電開始跑條帶，在電流與凝膠阻力的作用下，縱向會出現具有相同間隔有規律的條帶，它代表著不同的序列長度，在橫向分別對應ATGC?，F在，我們很容易就可以讀出下圖的DNA片段序列為 5’-GATTCGAGCTGA-3’。

現在推斷模板鏈（也就是待測片段）為 3’-CTAAGCTCGACT-5’

隨著物理及化學技術的發展，人們想到可以用相同的激發波長且具有不同發射波長的熒光基團標記 ddNTP（用一種激發光照射后，這些基團會有不同的光學顏色）?，F在，我們就可以把四種 ddNTP 放在同一體系下，通過光激發將四種光波長信號轉化為電腦可識別的電信號，在計算機眼里就會表現為不同的物質來處理。

這些新技術的加入使我們進入測序2.0時代，商用的二代測序是目前主流的測序技術，它以高度自動化測序儀為載體，實現了測序速度的提高，通量的升高，測序成本的減低，但是同時也會降低準確率。

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